تاریخ شروع : 1403/02/20
مهلت ارسال : 1403/03/17
گرنت صندوق نوآوری و شکوفایی:
حمایت بلاعوض از طرح تا سقف 600 میلیون تومان
حمایت بلاعوض از طرح تا سقف 600 میلیون تومان
مهلت ارسال پروپوزال به اتمام رسیده است
کیت جداسازی وزیکول‌های برون سلولی از مایعات بیولوژیک
خلاصه فناوری
در این طرح ستون‌های جداسازی وزیکول‌های برون سلولی با استفاده از پلیمر مناسب و با قابلیت استفاده حداقلی از نمونه زیستی، قابلیت حمل آسان و امکان استفاده در هر نوع محیط آزمایشگاهی طراحی می‌شوند. ابتدا نمونه زیستی شامل پلاسما، ادرار یا محیط کشت با حذف آلودگی‌های پروتئینی غیروزیکولی توسط محلول‌های خاص بهینه می‌شود. سپس با استفاده از مقدار کمی از مایعات زیستی، مانند نمونه پلاسما، سرم یا ادرار بیمار، جداسازی با خلوص بالای وزیکول‌ها با زیرمجموعه‌هایی در اندازه‌های 150-60 نانومتر (وزیکول‌های کوچک و بزرگ) انجام می‌شود. در مرحله بعد با استخراج DNA، RNA و محتوای پروتئینی این وزیکول‌ها با خلوص و کیفیت مناسب، بررسی‌های مولکولی و پروتئومیکس جهت تسریع روند درمان با پیش‌آگهی دقیقتر انجام خواهد شد.
ضرورت مسئله
وزیکول‌ها حاوی ترکیبات مولکولی مختلفی از سلول‌های منشأ خود از جمله پروتئین‌ها، DNA و RNA هستند. اگرچه ترکیب پروتئین وزیکول‌ها با سلول و بافت مبدأ متفاوت است، اکثر آن‌ها حاوی مجموعه‌ای مشترک از مولکول‌های پروتئینی هستند که از نظر تکاملی حفظ شده باقی مانده‌اند. محتوای پروتئین یک وزیکول منفرد، با توجه به فرضیات خاصی از اندازه و پیکربندی پروتئین و پارامترهای بسته‌بندی، میتواند حدود 000,20 مولکول باشد. محموله mRNA و miRNA در وزیکول‌ها برای اولین بار در دانشگاه گوتنبرگ سوئد کشف شدند.
محتوای وزیکول‌ها بسته به سلول‌های مبدأ آن‌ها تغییر می‌کند و در نتیجه آن‌ها اطلاعات سلول‌های منشأ خود را دارا می‌باشند. بنابراین تجزیه و تحلیل تنوع دینامیکی وزیکول‌ها ابزار ارزشمندی برای نظارت بر بیماری‌ها و تشخیص آن‌ها است. در دهه‌های اخیر جداسازی وزیکول‌ها از مایعات زیستی از جمله پلاسمای خون بیمار جهت بررسی مستقیم محتوای DNA، RNA بیانی و غیرکدکننده و پروتئین‌های آزاد شده از سلول، افق جدیدی را در مسیر تشخیص و درمان باز کرده است. رشد سالانه تجارت مرتبط با وزیکول‌ها در دنیا حدود 40 درصد بوده و شرکت‌های معتبر جهانی با روش‌های مختلف سعی در استخراج آن‌ها با خلوص بالا از نمونه‌های با حجم کم از بیمار هستند. علاوه بر این، وزیکول‌های برون سلولی به عنوان عوامل بدون سلول در سلول درمانی و تولید واکسن حائز اهمیت بوده و کاربرد دارند.
با توجه به وجود تحریم‌ها و هزینه ارزی بالای تهیه کیت‌های وارداتی برای جداسازی وزیکول‌های برون‌سلولی، استفاده از آن‌ها در داخل کشور در کاربردهای تشخیصی و بالینی چندان مقرون به صرفه نیست. با توجه به این موضوع، نیاز به تولید محصولی مناسب که با هزینه کمتر قابلیت رقابت با کیت‌های جداسازی وارداتی را داشته باشد بسیار محسوس است. در این طرح، ابزاری سریع و مقرون به صرفه ساخته خواهد شد که قابلیت جداسازی با خلوص بالای وزیکول‌ها از مایعات زیستی مختلف را دارا باشد.
مسئله اصلی تحقیق
وزیکول‌های برون‌سلولی کوچک، نانوذراتی با اندازه 150-30 نانومتر هستند که توسط سلول‌ها در فضای برون سلولی آزاد می‌شوند. وزیکول‌های با اندازه 150-60 نانومتر را اگزوزم و با اندازه کوچک‌تر از 50 نانومتر را اگزومر می‌نامند. وزیکول‌ها در مایع‌های مختلف موجود در بدن انسان، از جمله در خون، اشک چشم، شیر، بزاق، مایع مغزی نخاعی، ادرار و یا بافت‌های جامد بدن، آزاد شده و وجود دارند. وزیکول‌ها حامل ترکیبات DNA, RNA، پروتئین و متابولیت‌های قندی سلول‌هایی هستند که از آن‌ها آزاد می‌شوند. به همین دلیل، این بسته‌های کوچک درارتباطات بین سلولی نقش پراهمیتی دارند. محتوای این بسته‌های کوچک با نوع سلول‌های آزادکننده از نظر سلامتی یا بیماری سنخیت دارد. از این‌رو آن‌ها را می‌توان به‌عنوان نشانگرهای بالقوه زیستی در تشخیص بیماری، به‌عنوان واکسن‌های جدید و حامل‌های مولکولی و همچنین به‌عنوان نسل جدیدی از عوامل درمانی بدون سلول مورد استفاده قرار داد.
بیوپسی مایع امروزه به شکلی وسیع در تحقیقات بالینی سرطان مورد استفاده قرار گرفته و همچنین کاربردهای بالینی گوناگونی در تشخیص‌های مختلف دارد. امروزه استفاده از وزیکول‌ها به عنوان بیوپسی مایع نسبت به cfDNAها به دلیل پایداری بالاتر، حجم بیشتر در مایعات بدن و محتویات ژنتیکی و متابولیتی غنی‌تر، بیشتر مورد توجه قرار دارد. علاوه بر این، آن‌ها را می‌توان با روشی کم‌تهاجم‌تر از مایعات بدن جدا کرده و محتوای مولکولی پایدار آن‌ها را بررسی کرد که از سلول‌های بیمار، به‌عنوان مثال سلول‌های سرطانی، جدا شده‌اند. در نتیجه، در صورت به‌کارگیری این روش می‌توان با حساسیت بیشتر و با پیش‌آگاهی سریع‌تری از روند تشخیص و درمان به بهبود مناسب بیماری کمک کرد. به منظور استفاده از وزیکول‌ها به‌عنوان نشانگر زیستی در تشخیص‌های بالینی، باید ابتدا آن‌ها را با روشی مناسب و با خلوص بالا از مایع زیستی با کمترین حجم ممکن جدا کرده و سپس ذخیره کرد. در آزمایشگاه‌های تشخیصی، جداسازی آسان، سریع و با خلوص بالای وزیکول‌ها از ترکیب پیچیده مایعات بدن چالشی دشوار است. در دهه‌های اخیر و در مطالعاتی متعدد، روش‌های مختلفی برای جداسازی وزیکول‌ها ارائه شده است. یکی از روش‌های معمول برای جداسازی آن‌ها از اجزای مایعات بدن مانند آلودگی‌های پروتئینی، روش اولتراسانتریفیوژ تفریقی است. با این وجود، این روش آسان و مقرون به‌صرفه نیست. علاوه براین، نیروهای برشی شدیدی که در طول سانتریفیوژ با سرعت بالا به وزیکول‌ها وارد می‌شود، میتواند به ساختار غشایی آن‌ها آسیب وارد نماید. اولتراسانتریفیوژ همچنین منجر به جمع‌آوری وزیکول‌ها به همراه سایر ذرات و پروتئین‌های محلول در مایعات زیستی، مانند آلبومین در پلاسما می‌شود. روش‌های پیشرفته‌تری مانند اولتراسانتریفیوژ در شیب چگالی را می‌توان برای جداسازی وزیکول‌های با خلوص بالاتر مورد استفاده قرار داد. با این حال، این روش‌های پیشرفته‌تر بازدهی کمتری داشته و پیچیده، پرهزینه و وابسته به نحوه عملکرد اولتراسانتریفیوژ بوده و هنوز راه خود را در کاربردهای بالینی پیدا نکرده‌اند. از طرف دیگر، روش‌های آزمایشگاهی ارزان‌تر و آسان‌تری مبتنی بر ته‌نشینی از میان پلیمرهایی مانند پلی اتیلن گلیکول، دگستران و پلی وینیل در کیت‌های زیادی بهینه شده‌اند که قادر به جداسازی مقادیر بیشتری از وزیکول‌ها هستند. با این وجود، اشکال اصلی این روش‌ها آن است که نمی‌توانند وزیکول‌ها را با خلوص بالا استخراج کنند و سایر ذرات محلول و پلیمرها نیز در محصول نهایی موجود هستند. روش فلوسیتومتری نیز به شکلی گسترده برای شناسایی و جداسازی وزیکول‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش چندین مزیت مثل بازدهی بالا، قابلیت تجزیه و تحلیل چند پارامتری و جداسازی خالص وزیکول‌ها بسته به ترکیب سطحی آن‌ها را دارا است. با توجه به ضریب شکست کم و هتروژن بودن وزیکول‌ها از نظر اندازه، این ذرات باید به صورت فلورسانس با بیدهایی با اندازه مناسب برچسب‌گذاری شوند. همچنین باید ضریب شکستی مناسب برای بهبود همبستگی واحدهای پراکندگی ذرات با قطر متوسط استفاده شود. بنابراین پیش از استفاده از این روش در کاربردهای بالینی، باید آن را بهینه‌سازی کرد. به‌تازگی ابزارهای میکروشاره و تراشه‌های حسگری زیستی با موفقیت جهت جداسازی وزیکول‌ها با حجم نمونه کم مورداستفاده قرار گرفته‌اند. در این ابزارها از خواص الکترومغناطیسی، الکتروفورز و آکوستیکی برای جدا کردن ذرات با توجه به اندازه آن‌ها یا با استفاده از نشانگرهای خارجی استفاده می‌شود. برای استفاده گسترده در جداسازی وزیکول‌ها، این فناوری‌های جدید هنوز به طور کامل و بهینه توسعه نیافته‌اند و تحقیقات بیشتری در این زمینه مورد نیاز است. سوانگاری اندازه‌ای (SEC) روش دیگری است که برای جداسازی وزیکول‌ها از نمونه‌های زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این روش از پلیمری متخلخل متناسب با اندازه ذرات برای جداسازی آن‌ها استفاده می‌شود. هنگامی که مایع زیستی از پلیمر متخلخل عبور می‌کند، ذرات کوچک‌تر، مانند پروتئین‌ها، در منافذ پلیمر به دام افتاده و حرکت آن‌ها کند می‌شود؛ در حالیکه ذرات بزرگ‌تر مانند وزیکول‌ها به سرعت حرکت می‌کنند تا اینکه درنهایت از ستون کروماتوگرافی خارج می‌شوند. SEC روشی سریع و ساده است که در مقایسه با سایر روش‌ها محصولات اگزوزومی خالص‌تر و دست نخورده‌تری را ارائه می‌دهد. با استفاده از این روش می‌توان مقدار پروتئین‌های آلوده‌کننده را به میزان قابل توجهی کاهش داده و یکپارچگی وزیکول‌ها را حفظ کرد زیرا این ذرات توسط نیروهای فشاری کوچک یا گرانشی جدا می‌شوند. به‌طور معمول در SEC انواع مختلفی از پلیمرهای متخلخل یا رزین‌ها برای جداسازی وزیکول‌ها از مایعات زیستی و تصفیه و کاهش آلودگی‌های معمول آن‌ها، مانند لیپوپروتئین‌ها و آلبومین مورد استفاده واقع می‌شوند. مطالعات مختلفی در زمینه استفاده از SEC برای جداسازی وزیکول‌ها گزارش شده است که در آن‌ها بیشتر مشکلات مربوط به سایر روش‌ها برطرف شده‌اند. دراین طرح کیت جداسازی برپایه روش SEC ساخته خواهد شد که قادر به تفکیک زیرجمعیت‌های وزیکولی شامل L-Exoها، S-Exoها از کمترین حجم نمونه پلاسمای گرفته شده از خون بیمار (حدود 500 ماکرولیتر) و با حداقل آلودگی پروتئینی خواهد بود. جهت جداسازی زیرجمعیت‌های وزیکولی، عملکرد ستون SEC با بکارگیری پلیمر sephachryl-S400 بهینه خواهد شد. این پلیمر قابلیت جداسازی ذرات در اندازه های 20-80 کیلو دالتون را دارا است. برای جداسازی زیرجمعیت‌های وزیکولی با حداقل میزان نیاز به مایع بیولوژیک مانند پلاسما، حجم‌های متنوعی از پلیمر در ستون و با فشار جریان مناسب استفاده خواهند شد. شرایط بهینه مثل حجم پلیمر sephachryl-S400 موردنیاز و موقعیت قراگیری فریت‌ها بدست خواهند آمد. فریت‌های متخلل برای کاهش اختلال در فرآیند شستشوی ستون و جلوگیری از تجمع ذرات استفاده می‌شوند. جهت حذف آلودگی‌های پروتئینی غیروزیکولی از روش هضم آنزیمی توسط پروتئیناز K استفاده خواهد شد که مطابق با گزارش‌های موجود میتواند نقش مهمی در کاهش آپولیپوپروتئین‌های A1 و B، و آلبومین سرم و پلاسما داشته باشد. چون پروتئیناز K میتواند موجب هضم پروتئین‌های ساختاری در دو لایه فسفولیپیدی وزیکول‌ها و متلاشی کردن آن‌ها شود، بنابراین بهینه کردن غلظت پروتئیناز K مورد نیاز برای هضم پروتئین‌های غیراگزوزومال به تنهایی چالش بزرگی است. بدین منظور، نمونه‌هایی با غلظت‌های مختلف برای حذف این آلودگی‌ها تیمار و پس از استخراج وزیکول‌ها، آن‌ها از نظر ریخت‌شناسی، اندازه و CDمارکرهای اختصاصی بررسی خواهند شد تا غلظت مناسب پروتئیناز K بدست آید. به منظور تأیید حذف آلودگی‌ها، سطح پروتئین‌های آلبومین، Apo A و B1 با روش‌های BCA و SDS PAGE و نیز روش الایزا اندازه‌گیری می‌شوند.
با توجه به اینکه این روش کم هزینه بوده و وابستگی چندانی به استفاده از تجهیزات پیشرفته ندارد، می‌توان آن را به راحتی در محیط آزمایشگاه‌های مورد استفاده قرار داد. علاوه براین، ستون‌های کروماتوگرافی را می‌توان پس از هربار جداسازی چندین بار شستشو داده و مورد استفاده مجدد قرار داد. در این طرح، فناوری جداسازی اندازه‌ای بسته‌های وزیکولی از نمونه‌های کم حجم دریافت شده از بیمار (سرم، پلاسما، ادرار، مایع آمونیون جنین و اشک) یا محیط کشت جدا شده از سلول‌های بنیادی جهت سلول درمانی به‌دست آمده و وزیکول‌هایی با طیف وسیع جمعیتی از نظر اندازه و با حداقل آلودگی پروتئینی جداسازی می‌شود. روش جداسازی با ابزار ساخته شده در این طرح، نسبت به سایر روش‌های ترکیبی مورد استفاده بسیار ارزان‌تر خواهد شد. همچنین با مکانیزه‌سازی ابزار، قابلیت جداسازی زیر جمعیت‌های وزیکولی با سرعت بالا در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و تحقیقاتی بدون نیاز به کاربر متخصص مهیا خواهد شد.
در این طرح ستون‌های جداسازی وزیکول‌های برون سلولی با استفاده از پلیمر مناسب و با قابلیت استفاده حداقلی از نمونه زیستی، قابلیت حمل آسان و امکان استفاده در هر نوع محیط آزمایشگاهی طراحی می‌شوند. ابتدا نمونه زیستی شامل پلاسما، ادرار یا محیط کشت با حذف آلودگی‌های پروتئینی غیروزیکولی توسط محلول‌های خاص بهینه می‌شود. سپس با استفاده از مقدار کمی از مایعات زیستی، مانند نمونه پلاسما، سرم یا ادرار بیمار، جداسازی با خلوص بالای وزیکول‌ها با زیرمجموعه‌هایی در اندازه‌های 150-60 نانومتر (وزیکول‌های کوچک و بزرگ) انجام می‌شود. در مرحله بعد با استخراج DNA، RNA و محتوای پروتئینی این وزیکول‌ها با خلوص و کیفیت مناسب، بررسی‌های مولکولی و پروتئومیکس جهت تسریع روند درمان با پیش‌آگهی دقیقتر انجام خواهد شد.
ضرورت مسئله
وزیکول‌ها حاوی ترکیبات مولکولی مختلفی از سلول‌های منشأ خود از جمله پروتئین‌ها، DNA و RNA هستند. اگرچه ترکیب پروتئین وزیکول‌ها با سلول و بافت مبدأ متفاوت است، اکثر آن‌ها حاوی مجموعه‌ای مشترک از مولکول‌های پروتئینی هستند که از نظر تکاملی حفظ شده باقی مانده‌اند. محتوای پروتئین یک وزیکول منفرد، با توجه به فرضیات خاصی از اندازه و پیکربندی پروتئین و پارامترهای بسته‌بندی، میتواند حدود 000,20 مولکول باشد. محموله mRNA و miRNA در وزیکول‌ها برای اولین بار در دانشگاه گوتنبرگ سوئد کشف شدند.
محتوای وزیکول‌ها بسته به سلول‌های مبدأ آن‌ها تغییر می‌کند و در نتیجه آن‌ها اطلاعات سلول‌های منشأ خود را دارا می‌باشند. بنابراین تجزیه و تحلیل تنوع دینامیکی وزیکول‌ها ابزار ارزشمندی برای نظارت بر بیماری‌ها و تشخیص آن‌ها است. در دهه‌های اخیر جداسازی وزیکول‌ها از مایعات زیستی از جمله پلاسمای خون بیمار جهت بررسی مستقیم محتوای DNA، RNA بیانی و غیرکدکننده و پروتئین‌های آزاد شده از سلول، افق جدیدی را در مسیر تشخیص و درمان باز کرده است. رشد سالانه تجارت مرتبط با وزیکول‌ها در دنیا حدود 40 درصد بوده و شرکت‌های معتبر جهانی با روش‌های مختلف سعی در استخراج آن‌ها با خلوص بالا از نمونه‌های با حجم کم از بیمار هستند. علاوه بر این، وزیکول‌های برون سلولی به عنوان عوامل بدون سلول در سلول درمانی و تولید واکسن حائز اهمیت بوده و کاربرد دارند.
با توجه به وجود تحریم‌ها و هزینه ارزی بالای تهیه کیت‌های وارداتی برای جداسازی وزیکول‌های برون‌سلولی، استفاده از آن‌ها در داخل کشور در کاربردهای تشخیصی و بالینی چندان مقرون به صرفه نیست. با توجه به این موضوع، نیاز به تولید محصولی مناسب که با هزینه کمتر قابلیت رقابت با کیت‌های جداسازی وارداتی را داشته باشد بسیار محسوس است. در این طرح، ابزاری سریع و مقرون به صرفه ساخته خواهد شد که قابلیت جداسازی با خلوص بالای وزیکول‌ها از مایعات زیستی مختلف را دارا باشد.
مسئله اصلی تحقیق
وزیکول‌های برون‌سلولی کوچک، نانوذراتی با اندازه 150-30 نانومتر هستند که توسط سلول‌ها در فضای برون سلولی آزاد می‌شوند. وزیکول‌های با اندازه 150-60 نانومتر را اگزوزم و با اندازه کوچک‌تر از 50 نانومتر را اگزومر می‌نامند. وزیکول‌ها در مایع‌های مختلف موجود در بدن انسان، از جمله در خون، اشک چشم، شیر، بزاق، مایع مغزی نخاعی، ادرار و یا بافت‌های جامد بدن، آزاد شده و وجود دارند. وزیکول‌ها حامل ترکیبات DNA, RNA، پروتئین و متابولیت‌های قندی سلول‌هایی هستند که از آن‌ها آزاد می‌شوند. به همین دلیل، این بسته‌های کوچک درارتباطات بین سلولی نقش پراهمیتی دارند. محتوای این بسته‌های کوچک با نوع سلول‌های آزادکننده از نظر سلامتی یا بیماری سنخیت دارد. از این‌رو آن‌ها را می‌توان به‌عنوان نشانگرهای بالقوه زیستی در تشخیص بیماری، به‌عنوان واکسن‌های جدید و حامل‌های مولکولی و همچنین به‌عنوان نسل جدیدی از عوامل درمانی بدون سلول مورد استفاده قرار داد.
بیوپسی مایع امروزه به شکلی وسیع در تحقیقات بالینی سرطان مورد استفاده قرار گرفته و همچنین کاربردهای بالینی گوناگونی در تشخیص‌های مختلف دارد. امروزه استفاده از وزیکول‌ها به عنوان بیوپسی مایع نسبت به cfDNAها به دلیل پایداری بالاتر، حجم بیشتر در مایعات بدن و محتویات ژنتیکی و متابولیتی غنی‌تر، بیشتر مورد توجه قرار دارد. علاوه بر این، آن‌ها را می‌توان با روشی کم‌تهاجم‌تر از مایعات بدن جدا کرده و محتوای مولکولی پایدار آن‌ها را بررسی کرد که از سلول‌های بیمار، به‌عنوان مثال سلول‌های سرطانی، جدا شده‌اند. در نتیجه، در صورت به‌کارگیری این روش می‌توان با حساسیت بیشتر و با پیش‌آگاهی سریع‌تری از روند تشخیص و درمان به بهبود مناسب بیماری کمک کرد. به منظور استفاده از وزیکول‌ها به‌عنوان نشانگر زیستی در تشخیص‌های بالینی، باید ابتدا آن‌ها را با روشی مناسب و با خلوص بالا از مایع زیستی با کمترین حجم ممکن جدا کرده و سپس ذخیره کرد. در آزمایشگاه‌های تشخیصی، جداسازی آسان، سریع و با خلوص بالای وزیکول‌ها از ترکیب پیچیده مایعات بدن چالشی دشوار است. در دهه‌های اخیر و در مطالعاتی متعدد، روش‌های مختلفی برای جداسازی وزیکول‌ها ارائه شده است. یکی از روش‌های معمول برای جداسازی آن‌ها از اجزای مایعات بدن مانند آلودگی‌های پروتئینی، روش اولتراسانتریفیوژ تفریقی است. با این وجود، این روش آسان و مقرون به‌صرفه نیست. علاوه براین، نیروهای برشی شدیدی که در طول سانتریفیوژ با سرعت بالا به وزیکول‌ها وارد می‌شود، میتواند به ساختار غشایی آن‌ها آسیب وارد نماید. اولتراسانتریفیوژ همچنین منجر به جمع‌آوری وزیکول‌ها به همراه سایر ذرات و پروتئین‌های محلول در مایعات زیستی، مانند آلبومین در پلاسما می‌شود. روش‌های پیشرفته‌تری مانند اولتراسانتریفیوژ در شیب چگالی را می‌توان برای جداسازی وزیکول‌های با خلوص بالاتر مورد استفاده قرار داد. با این حال، این روش‌های پیشرفته‌تر بازدهی کمتری داشته و پیچیده، پرهزینه و وابسته به نحوه عملکرد اولتراسانتریفیوژ بوده و هنوز راه خود را در کاربردهای بالینی پیدا نکرده‌اند. از طرف دیگر، روش‌های آزمایشگاهی ارزان‌تر و آسان‌تری مبتنی بر ته‌نشینی از میان پلیمرهایی مانند پلی اتیلن گلیکول، دگستران و پلی وینیل در کیت‌های زیادی بهینه شده‌اند که قادر به جداسازی مقادیر بیشتری از وزیکول‌ها هستند. با این وجود، اشکال اصلی این روش‌ها آن است که نمی‌توانند وزیکول‌ها را با خلوص بالا استخراج کنند و سایر ذرات محلول و پلیمرها نیز در محصول نهایی موجود هستند. روش فلوسیتومتری نیز به شکلی گسترده برای شناسایی و جداسازی وزیکول‌ها مورد استفاده قرار می‌گیرد. این روش چندین مزیت مثل بازدهی بالا، قابلیت تجزیه و تحلیل چند پارامتری و جداسازی خالص وزیکول‌ها بسته به ترکیب سطحی آن‌ها را دارا است. با توجه به ضریب شکست کم و هتروژن بودن وزیکول‌ها از نظر اندازه، این ذرات باید به صورت فلورسانس با بیدهایی با اندازه مناسب برچسب‌گذاری شوند. همچنین باید ضریب شکستی مناسب برای بهبود همبستگی واحدهای پراکندگی ذرات با قطر متوسط استفاده شود. بنابراین پیش از استفاده از این روش در کاربردهای بالینی، باید آن را بهینه‌سازی کرد. به‌تازگی ابزارهای میکروشاره و تراشه‌های حسگری زیستی با موفقیت جهت جداسازی وزیکول‌ها با حجم نمونه کم مورداستفاده قرار گرفته‌اند. در این ابزارها از خواص الکترومغناطیسی، الکتروفورز و آکوستیکی برای جدا کردن ذرات با توجه به اندازه آن‌ها یا با استفاده از نشانگرهای خارجی استفاده می‌شود. برای استفاده گسترده در جداسازی وزیکول‌ها، این فناوری‌های جدید هنوز به طور کامل و بهینه توسعه نیافته‌اند و تحقیقات بیشتری در این زمینه مورد نیاز است. سوانگاری اندازه‌ای (SEC) روش دیگری است که برای جداسازی وزیکول‌ها از نمونه‌های زیستی مورد استفاده قرار می‌گیرد. در این روش از پلیمری متخلخل متناسب با اندازه ذرات برای جداسازی آن‌ها استفاده می‌شود. هنگامی که مایع زیستی از پلیمر متخلخل عبور می‌کند، ذرات کوچک‌تر، مانند پروتئین‌ها، در منافذ پلیمر به دام افتاده و حرکت آن‌ها کند می‌شود؛ در حالیکه ذرات بزرگ‌تر مانند وزیکول‌ها به سرعت حرکت می‌کنند تا اینکه درنهایت از ستون کروماتوگرافی خارج می‌شوند. SEC روشی سریع و ساده است که در مقایسه با سایر روش‌ها محصولات اگزوزومی خالص‌تر و دست نخورده‌تری را ارائه می‌دهد. با استفاده از این روش می‌توان مقدار پروتئین‌های آلوده‌کننده را به میزان قابل توجهی کاهش داده و یکپارچگی وزیکول‌ها را حفظ کرد زیرا این ذرات توسط نیروهای فشاری کوچک یا گرانشی جدا می‌شوند. به‌طور معمول در SEC انواع مختلفی از پلیمرهای متخلخل یا رزین‌ها برای جداسازی وزیکول‌ها از مایعات زیستی و تصفیه و کاهش آلودگی‌های معمول آن‌ها، مانند لیپوپروتئین‌ها و آلبومین مورد استفاده واقع می‌شوند. مطالعات مختلفی در زمینه استفاده از SEC برای جداسازی وزیکول‌ها گزارش شده است که در آن‌ها بیشتر مشکلات مربوط به سایر روش‌ها برطرف شده‌اند. دراین طرح کیت جداسازی برپایه روش SEC ساخته خواهد شد که قادر به تفکیک زیرجمعیت‌های وزیکولی شامل L-Exoها، S-Exoها از کمترین حجم نمونه پلاسمای گرفته شده از خون بیمار (حدود 500 ماکرولیتر) و با حداقل آلودگی پروتئینی خواهد بود. جهت جداسازی زیرجمعیت‌های وزیکولی، عملکرد ستون SEC با بکارگیری پلیمر sephachryl-S400 بهینه خواهد شد. این پلیمر قابلیت جداسازی ذرات در اندازه های 20-80 کیلو دالتون را دارا است. برای جداسازی زیرجمعیت‌های وزیکولی با حداقل میزان نیاز به مایع بیولوژیک مانند پلاسما، حجم‌های متنوعی از پلیمر در ستون و با فشار جریان مناسب استفاده خواهند شد. شرایط بهینه مثل حجم پلیمر sephachryl-S400 موردنیاز و موقعیت قراگیری فریت‌ها بدست خواهند آمد. فریت‌های متخلل برای کاهش اختلال در فرآیند شستشوی ستون و جلوگیری از تجمع ذرات استفاده می‌شوند. جهت حذف آلودگی‌های پروتئینی غیروزیکولی از روش هضم آنزیمی توسط پروتئیناز K استفاده خواهد شد که مطابق با گزارش‌های موجود میتواند نقش مهمی در کاهش آپولیپوپروتئین‌های A1 و B، و آلبومین سرم و پلاسما داشته باشد. چون پروتئیناز K میتواند موجب هضم پروتئین‌های ساختاری در دو لایه فسفولیپیدی وزیکول‌ها و متلاشی کردن آن‌ها شود، بنابراین بهینه کردن غلظت پروتئیناز K مورد نیاز برای هضم پروتئین‌های غیراگزوزومال به تنهایی چالش بزرگی است. بدین منظور، نمونه‌هایی با غلظت‌های مختلف برای حذف این آلودگی‌ها تیمار و پس از استخراج وزیکول‌ها، آن‌ها از نظر ریخت‌شناسی، اندازه و CDمارکرهای اختصاصی بررسی خواهند شد تا غلظت مناسب پروتئیناز K بدست آید. به منظور تأیید حذف آلودگی‌ها، سطح پروتئین‌های آلبومین، Apo A و B1 با روش‌های BCA و SDS PAGE و نیز روش الایزا اندازه‌گیری می‌شوند.
با توجه به اینکه این روش کم هزینه بوده و وابستگی چندانی به استفاده از تجهیزات پیشرفته ندارد، می‌توان آن را به راحتی در محیط آزمایشگاه‌های مورد استفاده قرار داد. علاوه براین، ستون‌های کروماتوگرافی را می‌توان پس از هربار جداسازی چندین بار شستشو داده و مورد استفاده مجدد قرار داد. در این طرح، فناوری جداسازی اندازه‌ای بسته‌های وزیکولی از نمونه‌های کم حجم دریافت شده از بیمار (سرم، پلاسما، ادرار، مایع آمونیون جنین و اشک) یا محیط کشت جدا شده از سلول‌های بنیادی جهت سلول درمانی به‌دست آمده و وزیکول‌هایی با طیف وسیع جمعیتی از نظر اندازه و با حداقل آلودگی پروتئینی جداسازی می‌شود. روش جداسازی با ابزار ساخته شده در این طرح، نسبت به سایر روش‌های ترکیبی مورد استفاده بسیار ارزان‌تر خواهد شد. همچنین با مکانیزه‌سازی ابزار، قابلیت جداسازی زیر جمعیت‌های وزیکولی با سرعت بالا در آزمایشگاه‌های تشخیص طبی و تحقیقاتی بدون نیاز به کاربر متخصص مهیا خواهد شد.
درباره تیم پژوهشی
| نام و نام‌خانوادگی | رشته/ مقطع تحصیلی | همکار/ مشاور طرح | وضعیت شغلی |
| محمدرضا رشیدیان وزیری | دکتری فیزیک اتمی-مولکولی | مجری فنی | هیئت‌علمی دانشگاه فردوسی مشهد |
| محمدرضا عباس‌زادگان | دکتری ژنتیک پزشکی | مجری فنی و علمی | هیئت‌علمی دانشگاه علوم پزشکی مشهد |
| سمانه شریف مشهدی | دکتری پزشکی مولکولی | مجری فنی و علمی | پژوهشگر مرکز تحقیقات ژنتیک دانشگاه علوم پزشکی مشهد |
| سینا مظفری جوین | دکتری پزشکی مولکولی | مجری علمی | هیئت‌علمی دانشگاه علوم پزشکی مشهد |
- جداسازی زیرجمعیت‌های وزیکولی باکیت موردنظر با حداقل میزان به‌کارگیری تجهیزات و صرف هزینه کمتر در مقایسه با کیت‌های خارجی جهت کاربرد در امر تشخیص
- طراحی کیت با قابلیت کار با مقادیر کم نمونه و زمان‌های کوتاه جداسازی
- جداسازی وزیکول‌ها بدون نیاز به تجهیزات پیشرفته مانند اولتراسانتریفیوژ
این محصول قابلیت جداسازی وزیکول‌های برون سلولی از جمله اگزوزم‌ها از مایعات زیستی مانند پلاسما، سرم، محیط کشت و ادرار را جهت تشخیص بیماری، تولید واکسن و دارو را داشته و همچنین برای انجام تحقیقات علمی و دانشگاهی کاربرد خواهد داشت.
- ابزار جداسازی وزیکول‌های خارج سلولی از مایعات بیولوژیک (این کیت قابلیت جداسازی 108×500 نانوذره اگزوزم از 500 میکرولیتر مایع بیولوژیک مانند پلاسما را دارد).
- کسب دانش جداسازی زیرجمعیت‌های وزیکولی با اندازه‌های 50 تا 200 نانومتر
- هزینه اجرای طرح حدود 600 میلیون تومان برآورد می‌شود.
- مدت‌زمان اجرای طرح حدود 8 ماه برآورد می‌شود.
- مالکیت معنوی: مشارکت‌کننده در مالکیت معنوی ناشی از اجرای تحقیق سهیم خواهد بود و انتشار مقاله مشترک توسط مجری و مشارکت‌کننده در ژورنال‌های داخلی و خارجی، ارائه مقاله در کنفرانس‌ها و سمینارها با موافقت و اشاره به نام همه دست‌اندرکاران مجاز خواهد بود.
- مالکیت منافع مادی: سهم مشارکت شرکت/شتاب‌دهنده متقاضی حداقل 10 و حداکثر 35 درصد خواهد بود (منافع مالی ناشی از توسعه این فناوری بر اساس توافق طرفین و مشترک خواهد بود و باتوجه به سهم آورده نقدی و غیرنقدی توسعه‌دهنده، سهم مالکیت قابل‌مذاکره و توافق است).
ارتباط با ما
شماره تماس:
021-88486498
اینستاگرام:
iran.challenges@
شماره تماس:
021-88486498
اینستاگرام:
iran.challenges@