Loading...
ایجاد یک رده سلولی CHO مهندسی‌شده با استفاده از تکنولوژی کریسپر
تاریخ شروع : 1403/02/24
مهلت ارسال : 1403/03/06
گرنت صندوق نوآوری و شکوفایی:
حمایت بلاعوض از طرح تا سقف 600 میلیون تومان



ایجاد یک رده سلولی CHO مهندسی‌شده با استفاده از تکنولوژی کریسپر

خلاصه فناوری
توسعه رده سلولی بخش مهمی از فرآیند تولید داروهای بیولوژیک است. از دیدگاه صنعتی دسترسی به رده‌های سلولی مناسب برای تولید بالا و سریع بسیار حائز اهمیت است. ایران در دهه گذشته موفقیت‌های چشمگیری در تولید و صادرات داروهای بیولوژیک کسب کرده است. اما فقدان رده‌های سلولی پلتفرم مناسب به عنوان یک ضعف در صنعت بیوفارمای ایران احساس می‌شود که شرکت‌های بیوفارما را ناچار به واردات رده‌های سلولی تولیدکننده با هزینه بالا از کشورهای دیگر می‌سازد. بنابراین، تولید رده‌های سلولی مهندسی شده که امکان تولید سریع رده سلولی پایدار و با تیتر بالا از هر پروتئین دارویی را فراهم ‌کند، از نقطه نظر صنعتی بسیار مهم است. روش سنتی توسعه رده‌ سلولی (CLD) مبتنی بر درج تصادفی ترنسژن، به علت ایجاد حوضچه ناهمگونی از سلول‌ها حاوی کپی‌های متعدد ترنسژن در نواحی مختلف ژنوم، با فرآیندهای غربالگری سخت، زمان‌بر و هزینه‌بر است. جدیدترین استراتژی‌‌ CLD در دنیا، مبتنی بر سیستم ترکیبی CRISPR/Cas9 و تعویض کاست به وسیله ریکامبیناز (RMCE) می‌باشد که با درج هدفمند لندینگ‌پدهای RMCE در مناطق ژنومی فعال از نظر رونویسی، امکان توسعه سریع رده‌های سلولی همگون با بیان بالا و پایدار را فراهم کرده و نیاز به فرآیندهای غربالگری را کاهش می‌دهد.
محصول نهایی این پروژه، 1 رده سلولی CHO مهندسی شده به عنوان پلتفرمی جهت توسعه سریع رده­های سلولی تولیدکننده خواهد بود که بر پایه جدیدترین راهبردهای بیوتکنولوژی به کار رفته در دنیا (روش ویرایش ژنوم با تکنیک CRISPR/CAS9)  ایجاد خواهد شد. این سلول می­تواند به عنوان پلتفرمی جهت تولید سریع (در بازه زمانی کمتر از 1 سال)، کارآمد و با تیتر بالای انواع (گلیکو) پروتئین­های دارویی (در مقیاس بیش از 1 g/lit) از جمله آنتی بادی­های مونوکلونال مورد استفاده قرار گیرد.


ضرورت مسئله
سلول‌های تخمدان همستر چینی (CHO) با دارا بودن خصوصیات رشد و تولید بهینه، ایجاد تغییرات پس از‌ ترجمه شبه انسانی، سهولت انجام دستکاری‌های ژنتیکی، گستردگی سیستم‌های انتخابی در دسترس، حساسیت پایین نسبت به آلودگی‌های ویروسی و سابقه گسترده در اخذ تایید دارو، میزبان اصلی جهت تولید صنعتی پروتئین­های دارویی محسوب می‌شوند. به طوری‌که، تقریبا 70 درصد از داروهای بیولوژیک و همه آنتی‌بادی‌های‌ مونوکلنال در سلول CHO تولید می‌شوند. تولید هر پروتئین دارویی به ایجاد یک رده سلولی پایدار با تیتر تولید بالا و کیفیت مطلوب و پایدار محصول نیازمند است. بنابراین توسعه رده سلولی (CLD)، یکی از مراحل اساسی در فرآیند تولید داروهای نوترکیب است. فرآیند سنتی CLD شامل درج تصادفی (RI) ترنسژن در ژنوم میزبان و به دنبال آن فرآیندهای غربالگری سخت و زمان‌بر جهت شناسایی کلون‌های با بیان بالا و پایدار می‌باشد. اگرچه اين روش در ايجاد رده‌های ســلولی تجاری با پروداكتیويتی بالا (g/l~) موفقیت آمیز بوده اســت، اما به علت ماهیت تصادفی بودن درج ترنسژن و عدم کنترل بر روی جایگاه درج، با مشکلات اساسی همراه است.
توسعه رده­های سلولی با پلتفرم مناسب برای توسعه سریع رده­های سلولی پایدار و با تولید بالا بخش مهمی از فرآیند تولید داروهای بیولوژیک است.
با توجه به پیشرفت­های چشمگیر ایران در دهه­ی گذشته در تولید و صادرات داروهای بیولوژیک، فقدان رده­های سلولی با پلتفرم مناسب به عنوان یک ضعف عمده در صنعت داروهای بیولوژیک ایران احساس می­شود که شرکت­های تولید کننده­ محصولات بیولوژیک را ناچار به واردات رده­های سلولی تولیدکننده با هزینه بالا از کشورهای دیگر می­سازد.
تاکنون، فناوری تولید خطوط سلولی پلتفرم در ایران توسعه نیافته است. بنابراین پروژه فعلی برای شرکت­های فعال در صنعت بیوفارما بسیار امیدوارکننده و ارزشمند خواهد بود.
توسعه رده سلولی پلتفرم مورد نظر در این مطالعه، با کوتاه کردن فرآیندهای غربالگری مورد نیاز در توسعه رده‌های سلولی نوترکیب، منجر به ایجاد یک فناوری تکرارپذیر و کارآمد جهت توسعه سریع رده‌های سلولی تولید کننده پایدار و با تیتر بالا از انواع داروهای بیولوژیک خواهد شد. با توجه به سرعت توسعه داروهای بیولوژیک جدید، اخذ مجوز FDA و ورود به بازار در بازارهای دارویی دنیا و همچنین رشد سریع صنعت بیوفارمای ایران در توسعه داروهای بیوسیمیلار در سال‌های اخیر و بازار رو به رشد این داروها، سالانه درخواست توسعه 8-7 رده سلولی تولید کننده وجود دارد که پس از توسعه رده سلولی پلتفرم، امکان تامین 5 مورد از این درخواست‌ها در طی پنج سال وجود خواهد داشت. قیمت فروش هر رده سلولی وارداتی 150 میلیارد ریال می‌باشد.

 
مسئله اصلی تحقیق
 از زمان ظهور سیستم، این تکنولوژی به وفور جهت درج هدفمند ژن در سلول CHO مورد استفاده قرار گرفت. درج هدفمند ژن‌های کدکننده پروتئین‌های درمانی و کلون­های ایجاد شده به این روش به علت کنترل بر جایگاه درج و درج هدفمند در نواحی hot spot ژنومی یا safe harbor ها، هوموژنیتی و پروداکتیویتی بالا از خود نشان می‌دهند. در نتیجه نیاز به غربالگری­های طولانی و سخت بر روی تعداد زیادی از کلون‌ها، در پروسه تولید حذف شده است. از طرفی به علت حذف اثرات لوکال کروموزومی، کلون‌های بدست آمده بیان تکرارپذیر و پایدارتری از خود نشان می‌دهند. کارایی بالای هدف‌گیری، طراحی آسان و مقرون به صرفه بودن از دیگر مزایای این سیستم می‌باشد. در سال‌های اخیر، سیستم هیبریدی بر مبنای ترکیبی از RMCE و CRISPR/Cas9 با هدف غلبه بر محدودیت‌های موجود در هر یک از این سیستم‌ها ایجاد شده و جهت توسعه رده‌های سلولی صنعتی تولید کننده پروتئین‌های دارویی بسیار مورد توجه کمپانی‌های بزرگ بیوفارما قرار گرفته است. در این روش، لندینگ‌پدهای RMCE با استفاده از سیستم CRISPR/Cas9 در نواحی از پیش تعیین شده در ژنوم درج می‌شوند. به این ترتیب بر محدودیت‌های ناشی از درج تصادفی در RMCE و محدویت سایزی سیستم CRISPR غلبه کرده و امکان ایجاد سریع رده‌های سلولی همگون و پایدار را فراهم می‌کند. در واقع از درج هدفمند بوسیله‌ی CRISPR/Cas9 جهت ایجاد MCL یا همان سلول پلتفرم استفاده شده است و سپس این سلول با دارا بودن قابلیت هدف‌گیری و استفاده مجدد لندینگ­پد از طریق تعویض کاست، می‌تواند به عنوان پلتفرمی جهت تولید انواع پروتئین‌های دارویی مورد استفاده قرار گیرد. پس از ایجاد MCL، سیستم ترکیبی، امکان توسعه سریع رده‌های سلولی تولید کننده انواع    پروتئین‌های دارویی را فراهم می‌کند. همچنین استفاده از MCLهای مشتق از یک تک کلون، منجر به ایجاد کلون‌های ایزوژنیک
با حداقل هتروژنیتی از سلولی به سلول دیگر و در نتیجه حذف مراحل غربالگری سخت و زمان بر می‌گردد.
در ادامه‌ی استفاده از سیستم هیبرید CRISPR/Cas9 و RMCE جهت درج هدفمند لندینگ‌پد در نواحی hot spot ژنومی، توجه تحقیقات و همچنین صنعت به سمت افزایش تعداد لندینگ‌پدها در لکوس‌های 
مختلف قرار گرفت تا سلول پایه حاوی چند لندینگ­پد قابل استفاده جهت درج کاست ژنی ایجاد شود. افزایش تعداد لندینگ­پدها، امکان افزایش بیان پروتئین از طریق افزایش تعداد کپی‌های درج شده از ترنسژن و یا بیان ژن‌های موثر در مهندسی سلول CHO از نظر خصوصیات رشد و پروداکتیویتی را فراهم می‌کند. هدف از مطالعه حاضر، ایجاد یک سلول CHO پلتفرم حاوی دو لندینگ­پد (حاوی جایگاه شناسایی اینتگراز Bxb1 به همراه مارکرهای انتخابی( در دو لکوس از کلاستر ژنی S100A با استفاده از تکنولوژی CRIS-PITCh می‌باشد. سپس با استفاده از بیان موقت اینتگراز و از طریق RMCE یکی از دو لندینگ‌پد، جهت درج کاست ژنی کد کننده یک پروتئین دارویی و دیگری جهت بیان پایدار miR-17 به منظور مهندسی پایدار سلول CHO مورد استفاده قرار خواهد گرفت.
 miR-17 به چند علت به این منظور انتخاب شد:
  1. توانایی مهندسی و بهبود خصوصیات سلول CHO هم از نظر رشد و هم قابلیت‌های تولید (پروداکتیویتی)
  2. اثرات pro-productive این microRNA در حالت بیان پایدار نیز ثابت شده است.
  3. miR-17 در مقایسه با سایر miRNA ها اثرات مثبت بیشتری در بهبود پروداکتیویتی سلول CHO از خود نشان داده است (افزایش سه برابری تیتر و دو برابری qP)
  4. در مقایسه با سایر miRNA ها ، اثرات مثبت miR-17 در بهبود رشد و پروداکتیویتی سلول CHO بوسیله مطالعات بیشتری ثابت شده است.
به این ترتیب، در نهایت یک سلول CHO مهندسی شده حاوی دو لندینگ­پد، با خصوصیات بهبود یافته از نظر رشد و تولید ایجاد خواهد شد که می‌تواند به عنوان پلتفرمی، جهت توسعه سریع رده‌های‌ سلولی تولیدکننده‌ی تیتر بالایی از انواع پروتئین‌های دارویی مورد استفاده قرار گیرد.
درباره تیم پژوهشی
 
نام و نام خانوادگی رشته/مقطع تحصیلی همکار/مشاور طرح وضعیت شغلی
فاطمه دوامی دکتری تخصصی بیوتکنولوژی دارویی مجری عضو هیات علمی بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران
ستاره ادیب­زاده دانشجوی دکتری بیوتکنولوژی پزشکی همکار دانشجوی دکتری تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران
الهام بیات کارشناس ارشد سلولی مولکولی همکار کارشناس آزمایشگاه
نگین سادات هاشمی کارشناس علوم آزمایشگاهی همکار کارشناس آزمایشگاه

سوابق عرضه‌کننده فناوری و مسئول اصلی تیم پژوهشی
دکتر فاطمه دوامی،  دکتری بیوتکنولوژی دارویی، داروساز و استاد تمام بخش بیوتکنولوژی انستیتو پاستور ایران بوده و از سال 82 در حوزه بیوتکنولوژی دارویی فعالیت داشته­اند. همچنین حدود ده سال در حوزه ارتباط با صنایع بیوفارما و تولید آنتی­بادی­های منوکلونال درمانی طرح­هایی را به انجام رسانده­اند. ایشان در 8 سال گذشته در حوزه توسعه رده­ی نوترکیب با تکنیک ویرایش ژنومی فعالیت نموده­اند. راهنمایی و مشاوره بیش از 20 پایان­نامه دکترای تخصصی و کارشناسی­ارشد و 20 طرح تحقیقاتی مصوب، چاپ 50 مقاله ISI  و دو کتاب با عناوین " دارو درمانی هدفمند سرطان: رویکرد ویژه به آنتی­بادی های منوکلونال" و " آنتی­بادی­های منوکلونال چالشی نوین در عرصه زیست فناوری"  از جمله فعالیت­های نامبرده در حوزه تولید پروتئین­های نوترکیب و ویرایش ژنومی سلول CHO بوده است.

ستاره ادیب‌زاده، دانشجوی دکترای بیوتکنولوژی پزشکی که پایان نامه خود را  با موضوع مهندسی سلول CHO  با بهره گیری از تکنیک CRISPR، از سال 1400 تحت راهنمایی دکتر دوامی در دست  اجرا دارند.
مزایا
  •  هزینه ساخت و غربال‌گری پایین‌­تر و درنتیجه قیمت تمام شده پایین‌­تر
  • مدت زمان کمتر مورد نیاز برای توسعه یک رده سلولی
  • افزایش سرعت تولید
  • مبتنی بر دانش فنی
  • ایجاد یک فناوری تکرارپذیر و کارآمد جهت توسعه سریع رده‌­های سلولی.
کاربرد
استفاده در مزارع کشاورزی خصوصا مزارع زعفران و باغات پسته‌ای که قصد دارند محصول خود را صادر نمایند. همچنین برای کنترل علف‌های هرز در کشت‌های ارگانیک کاربرد دارد.
خروجی‌های مورد انتظار تحقیق
محصول نهایی این پروژه، یک رده سلولی CHO مهندسی شده به عنوان پلتفرمی جهت توسعه سریع رده‌های سلولی تولیدکننده خواهد بود که بر پایه جدیدترین راهبردهای بیوتکنولوژی به کاررفته در دنیا (روش ویرایش ژنوم با تکنیک CRISPR/Cas9)  ایجاد خواهد شد. این سلول می‌تواند به عنوان پلتفرمی جهت تولید سریع (در بازه زمانی کمتر از یک ساله) ، کارآمد و با تیتر بالای انواع (گلیکو)پروتئین‌های دارویی ) در مقیاس بیش  از 1 (g/lit) از جمله آنتی بادی‌های مونوکلونال مورد استفاده قرار گیرد.
هزینه و زمان اجرای طرح
  • هزینه اجرای طرح حدود 600 میلیون تومان برآورد می‌شود.
  • مدت‌زمان اجرای طرح حدود 24 ماه می‌باشد.
تسهیم مالکیت فکری
  • مالکیت معنوی: مشارکت‌کننده در مالکیت معنوی ناشی از اجرای تحقیق سهیم خواهد بود و انتشار مقاله مشترک توسط مجری و مشارکت‌کننده در ژورنال‌های داخلی و خارجی، ارائه مقاله در کنفرانس‌ها و سمینارها با موافقت و اشاره به نام همه دست‌اندرکاران مجاز خواهد بود.
  • مالکیت منافع مادی: سهم مشارکت شرکت/شتاب‌دهنده متقاضی حداقل 10 و حداکثر 35 درصد خواهد بود (منافع مالی ناشی از توسعه این فناوری بر اساس توافق طرفین و مشترک خواهد بود و باتوجه‌به سهم آورده نقدی و غیرنقدی توسعه‌دهنده، سهم مالکیت قابل‌مذاکره و توافق است).
ارتباط با ما
شماره تماس:
021-88486498

اینستاگرام:
iran.challenges@